核酸の検出

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⬛核酸の検出の仕方

遺伝子である核酸を検出するためには、
　核酸抽出
　核酸増幅（PCR）
　増幅産物検出
の三段階を経る。

核酸抽出	細胞破壊・均質化 ラウリル硫酸ナトリウム（界面活性剤）、リゾチーム（細胞壁破壊）などを用いる。
	蛋白変性 プロテイナーゼKで蛋白質を切断・除去し、フェノールやクロロホルムなどで核酸を分離する。
	精製 エタノール沈殿：エタノールと塩（酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウムなど）を用いる。 核酸の純度は、260nm（核酸の極大吸収）の吸光度と280nm（蛋白質の極大吸収）の吸光度の比で確認する。理想は、260/280が1.7~2.0。
核酸増幅 （PCR） 1~3を繰り返す	1.熱変性 94℃前後。 二本鎖の核酸を一本鎖にほどく。 GC含有率が解離温度を決定する。 全DNAの50%が一本鎖に解離する温度をTm値という。
	2.アニーリング 55~60℃。 アニーリングとは、一本鎖DNAを二本鎖DNAにすること。 プライマーを標的DNAに結合させる。 プライマー：18~23bp。2つのプライマー間あるいは1つのプライマーでアニーリングしないように3'末端はAをさける。GC含有率は40~60%。
	3.伸長 72℃。 Buffer：DNAポリメラーゼの補酵素であるMg2+を含む。 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP taqポリメラーゼ：耐熱性
	保存 4℃。
増幅産物検出	電気泳動 支持体：アガロースゲル
	観察・撮影 エチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネーターでUVを照射してバンドを観察する。 遺伝子の長さの目安になるマーカーを一緒に泳動して増幅産物の長さを確認する。 増幅産物のバンドが一本でない場合、非特異的な増幅が考えられる。 ポラロイドカメラで撮影する。

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